Một nhóm các nhà nghiên cứu liên ngành do Penn State dẫn đầu đã phát triển các kỹ thuật để cải thiện hiệu quả của CRISPR-Cas9, kỹ thuật chỉnh sửa bộ gen đã giành được giải thưởng Nobel năm 2020. Trong khi CRISPR-Cas9 nhanh hơn, ít tốn kém hơn và chính xác hơn các phương pháp chỉnh sửa gen khác theo trưởng dự án Xiaojun “Lance” Lian, phó giáo sư kỹ thuật y sinh và sinh học tại Penn State, công nghệ này có những hạn chế – đặc biệt là trong các ứng dụng để cải thiện sức khỏe con người.
Các nhà nghiên cứu đã phát triển một quy trình hiệu quả hơn và dễ tiếp cận hơn để áp dụng các hệ thống CRISPR-Cas9 trong các tế bào gốc đa năng của con người (hPSC), có nguồn gốc từ các dòng tế bào gốc được liên bang phê duyệt, mà Lian cho biết có thể thúc đẩy đáng kể việc chẩn đoán và điều trị các rối loạn di truyền. Cách tiếp cận đã được xuất bản vào ngày 7 tháng 9 trong Phương pháp báo cáo di động.
CRISPR-Cas9, viết tắt của cụm lặp lại ngắn palindromic thường xuyên xen kẽ theo cụm và protein liên quan đến CRISPR 9, mang đến cho các nhà khoa học khả năng nhắm mục tiêu các vị trí chính xác của mã di truyền để thay đổi DNA, tạo cơ hội tạo ra các công cụ chẩn đoán mới và có khả năng sửa chữa các đột biến để điều trị các nguyên nhân di truyền của bệnh tật.
Lian nói: “Bộ gen của con người rất lớn và CRISPR-Cas9 giúp các nhà khoa học có thể tìm và nhắm mục tiêu một gen đột biến để nghiên cứu nó.
CRISPR sử dụng một đĩa vật liệu di truyền, được gọi là DNA plasmid, để cung cấp axit ribonucleic (RNA) được hướng dẫn để định vị enzyme Cas9 tại vị trí chính xác của gen mục tiêu. Khi DNA được định vị, Cas9 sẽ liên kết với nó và cắt nó ra, cho phép các DNA khác sửa chữa vết cắt. Sau đó, các nhà nghiên cứu có thể xem việc loại bỏ thay đổi biểu hiện của gen như thế nào. Nhưng có những vấn đề về hiệu quả phân phối và chỉnh sửa với các phương pháp CRISPR dựa trên DNA hiện tại, theo Lian.
Ông nói: “Việc cung cấp DNA CRISPR effectors thấp. “Chỉ 20% đến 30% các tế bào được nhắm mục tiêu sẽ nhận được DNA chỉnh sửa gen khi sử dụng CRISPR. Việc đưa RNA vào tế bào có thể hiệu quả hơn; tuy nhiên, khi RNA thông thường được đưa vào, các tế bào có thể coi đó là vi-rút. Chúng phá hủy RNA trước khi nó có thể tạo ra protein — chẳng hạn, trong vài giờ — và khi làm như vậy, sẽ phá hủy nỗ lực chỉnh sửa gen.”
Để cải thiện kết quả, các nhà nghiên cứu đã thay đổi cách các công cụ chỉnh sửa bộ gen được chuyển đến các tế bào gốc, sử dụng RNA đã được sửa đổi (modRNA). ModRNA khác với DNA plasmid ở chỗ nó thay thế một trong các chất nền cơ bản có trong RNA bằng một phiên bản biến đổi về mặt hóa học và nó được ổn định nhờ hỗ trợ cấu trúc mạnh hơn.
Lian cho biết: “ModRNA được phát hiện là hiệu quả hơn đáng kể so với DNA plasmid. “Khoảng 90% tế bào đã nhận được modRNA từ một lần chuyển đổi đơn giản, vì vậy nó có thể giữ nguyên vị trí và thực hiện công việc của mình.”
Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện ra rằng khoảng thời gian modRNA ở đúng vị trí là lý tưởng: đủ lâu để sửa đổi các tế bào nhưng không quá lâu để gây ra hoạt động ngoài mục tiêu. Nhưng modRNA đã gây ra một vấn đề khác, theo Lian.
Khi modRNA Cas9 được chuyển thành công đến gen mục tiêu, nó sẽ tạo ra sự đứt gãy sợi đôi trong bộ gen, mà một số tế bào sẽ cố gắng khắc phục. Những cái tự sửa chữa có thể truyền lại sự sửa chữa hay còn gọi là “đột biến” cho thế hệ con cháu của chúng. Đây là quá trình mà các nhà nghiên cứu muốn hiểu rõ hơn, vì vậy đây là những tế bào mà họ muốn thu thập và nghiên cứu. Lian cho biết, vấn đề là hầu hết các tế bào bị đứt gãy này đều xác định đó là một vấn đề lớn với bộ gen và sẽ tự hủy thay vì cố gắng tự sửa chữa.
Để giảm tác dụng phụ độc hại của Cas9 và giúp các tế bào được chỉnh sửa tồn tại, nhóm của Lian đã giới thiệu một loại protein nhỏ giúp tế bào phát triển. Theo Lian, loại protein được thêm vào này đã ức chế quá trình chết tế bào và cải thiện hiệu quả chỉnh sửa Cas9 lên tới 84%.
Các nhà nghiên cứu cũng phát hiện ra rằng modRNA có thể cải thiện các kỹ thuật chỉnh sửa gen khác, chẳng hạn như chỉnh sửa cơ sở. Chỉnh sửa cơ sở có thể loại bỏ các gen hoặc sửa các đột biến trong bộ gen bằng cách sử dụng một loại protein để thay đổi một nucleotide đơn lẻ thay vì cắt cả hai sợi như CRISPR đã làm.
Lian cho biết: “Chúng tôi đã chuyển các tế bào gốc bằng protein chỉnh sửa cơ sở dựa trên plasmid hoặc dựa trên modRNA. “Phương pháp dựa trên modRNA của chúng tôi hiệu quả hơn gấp bốn lần, ở mức 68%, so với kỹ thuật dựa trên plasmid, ở mức khoảng 16%, trong việc chỉnh sửa thành công bộ gen.”
Theo Lian, khi có nhiều phòng thí nghiệm chỉnh sửa gen cải thiện hiệu suất và hiệu suất chỉnh sửa gen, các nhà nghiên cứu sẽ có thể hiểu rõ hơn về gen và chức năng của chúng nhanh hơn.
“Cơ thể con người có hơn 20.000 gen, nhưng chúng tôi chỉ nghiên cứu chức năng của khoảng 10% trong số đó”, Lian nói. “Việc kiểm tra mục đích của từng gen còn lại, từng gen một, có thể mất cả cuộc đời. Việc sử dụng các tế bào gốc được thiết kế từ các kỹ thuật chỉnh sửa gen hiệu quả cao của chúng tôi có thể đẩy nhanh quá trình này.”
Giáo sư Jian Yang và các sinh viên tiến sĩ Tahir Haideri, Alessandro Howells và Yuqian Jiang, tất cả đều thuộc Khoa Kỹ thuật Y sinh Bang Penn, cũng như Xiaoping Bao của Đại học Purdue, đã đóng góp cho công trình này. Lian và Yang được liên kết với Viện Khoa học Đời sống Huck. Lian cũng liên kết với Khoa Sinh học tại Penn State.
Quỹ Khoa học Quốc gia, Viện Y tế Quốc gia và Penn State đã hỗ trợ công việc này.
